Absolute Quantification by droplet digital PCR versus Analog real-time PCR

中国福彩网山西站 www.dfpifn.com.cn 入選理由:首次將ddPCR和qPCR在miRNA表達含量分析時結果的重復性進行了系統的統計學比較,證實了ddPCR方法的優勢。具有較高的引用率。

發表期刊:Nature Methods | ADVANCE ONLINE PUBLICATION doi:10.1038/nmeth.2633
作者:Christopher M Hindson, John R Chevillet, Hilary A Briggs, Emily N Gallichotte, Ingrid K Ruf, Benjamin J Hindson, Robert L Vessella & Muneesh Tewari;

文章摘要:
來自Fred Hutchinson癌癥研究中心等處的研究人員在《Nature Methods》發表文章證明了微滴式數字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR)技術能用于不同情況下,準確,可重復性的血漿和血清microRNA(miRNA)量化檢測,這將為miRNA及其它核酸用于循環生物標志物的檢測鋪墊了道路。

文章的第一作者,Fred Hutchinson癌癥研究中心人類生物學部Muneesh Tewari博士表示,“在循環系統miRNA診斷領域,微滴式數字PCR(ddPCR)能幫助我們進行生物標記物研究,直接比較同一實驗室跨天多次試驗,甚至不同實驗室之間的檢測結果?!?/span>

實時定量PCR(qPCR)已被廣泛用于血液樣品miRNA的分析測試中。但是研究人員發現,血清或血漿中的miRNA qPCR測量出現了極高的差異性,無法用作穩定的血液生物標志物的檢測標準,因此這一領域的研究人員一直在尋求一種能獲得更可靠結果的新方法。

數字PCR具有許多優于定量PCR的優點,比如無需標準曲線,以及不受不同樣品和試驗過程中PCR擴增效率變化的影響,就能獲得絕對定量。

為了評估每個工作流程的步驟,包括連續稀釋準備,反轉錄(RT)和PCR擴增,Tewari博士和他的團隊分別在三個獨立的工作日中,通過ddPCR嵌套分析對比定量PCR,對水和血漿中6種不同的合成miRNA各稀釋系列的cDNA進行分析,結果發現比較于qPCR,ddPCR在PCR特異性變化方面,具有更高的精確度(48-72%的更少變異系數)。

接下來,研究小組進行血清miRNA的qPCR和ddPCR并列比較檢測。他們收集了20例晚期前列腺癌患者,和20例年齡相匹配的男性對照血清樣品,分析其中的miR-141豐度,miR-141是一種已被證明的晚期前列腺癌的生物標志物。 研究人員分別在不同的三天里準備了qPCR和ddPCR分析的不同稀釋濃度,并進行了檢測,結果發現ddPCR相比于qPCR,能提高7倍不同一天里實驗室的重復率,這在對照研究中也得到了證實:ddPCR的結果更為可信(p=0.0036 vs. p=0.1199)。

Tewari博士說,“微滴式數字PCR將能幫助我們更加精確的追蹤病人治療期間不同時間段中的血清microRNA生物標志物濃度變化情況,這對于實時PCR來說,有時是不可能實現的?!?/span>

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