Akonni TruTip and Qiagen Methods for Extraction of Fetal Circulating DNA – Evaluation by Real-Time and Digital PCR

Akonni TruTip and Qiagen Methods for Extraction of Fetal Circulating DNA – Evaluation by Real-Time and Digital PCR

入選理由:ddPCR作為一種高靈敏度檢測手段的出現,必將對上游的核酸純化產業帶來壓力。該文是ddPCR技術大規模應用后,第一篇致力于針對具體的應用改善核酸純化方法的應用文章。

發表期刊:PLOS ONE. August 2013 | Volume 8 | Issue 8 | e73068
作者:Rebecca C. Holmberg, Alissa Gindlesperger, Tinsley Stokes, David Lopez, Lynn Hyman, Michelle Freed, Phil Belgrader, Jeanne Harvey, Zheng Li;

文章摘要:
很多利用定量PCR方法進行低拷貝核酸檢測的研究人員很關心的問題之一就是檢測的靈敏度,也就是說能夠在多少拷貝的水平實現DNA或RNA分子穩定的檢出。其實靈敏度主要取決于2個主要的方面:樣品中核酸提取的效率和具體檢測體系的靈敏度,兩者一起決定了具體目標序列的檢測靈敏度。

隨著超靈敏度的微滴式數字PCR技術的出現,使得核酸純化成為低拷貝模板檢測過程中的瓶頸與限制性實驗步驟,對從樣品中進行高效的核酸分子提取提出了更高的要求。由Akonni Biosystems和Novartis的科學家共同完成的這篇文章以無創產前診斷或篩查(NIPD或NIPT)的應用為例,比較了Akonni Biosystems的TruTip和QIAGEN的Circulating Nucleic Acids試劑盒對于cffDNA提取的效果。對得到的核酸提取物分別采用定量PCR和ddPCR進行了分析,得到的結果顯示Akonni Biosystems對于片段化的胎兒游離DNA提取的得率比QIAGEN的試劑盒提高了約87%,且定量PCR的結果與ddPCR結果相關性良好。

對于核酸序列高效的提取,該文獻中雖然以NIPD或NIPT的應用為例,但對于其他的應用也具有重要的意義,例如從血漿或血清樣品中對腫瘤相關突變的早期檢測等。

Noninvasive Detection of Response and Resistance in EGFR-Mutant Lung Cancer Using Quantitative Next-Generation Genotyping of Cell-Free Plasma DNA

Noninvasive Detection of Response and Resistance in EGFR-Mutant Lung Cancer Using Quantitative Next-Generation Genotyping of Cell-Free Plasma DNA

入選理由:首次以血漿游離DNA作為樣品,采用ddPCR技術對非小細胞肺癌病人TKI治療過程中的耐藥性突變位點進行檢測,證實了這種方法的可行性。

發表期刊:Clin Cancer Res 2014;20:1698-1705;
作者:Geoffrey R. Oxnard, Cloud P. Paweletz, Yanan Kuang, et al.;

文章摘要:
TKI靶向治療肺癌是個性化治療的范例之一,隨著個性化治療的深入,如何改變臨床實踐來確保最大程度發揮靶向治療的作用非常重要。這樣才能使可能獲益的患者應用具有針對性的靶向藥物,同時使不適宜靶向藥物治療的病人遠離那些藥物。

發表于Clinical Cancer Research上的該文章采用微滴式PCR的方法對晚期肺癌、黑色素細胞瘤病人的血漿游離腫瘤DNA進行EGFR、KRAS和BRAF的檢測,希望能找到一種特異性好、靈敏度高的方法對病人腫瘤的基因型進行分析,試圖克服目前常規檢測方法繁瑣、假陽性率高的問題。由于采用病人的血漿樣品,因此這種方法對病人而言是非侵入性的,更重要的能夠對肺癌病人在接受Erlotinib治療后對療效進行評估,并對可能產生的耐藥突變進行監測,如T790M。

文章對9個接受厄洛替尼一線治療的病人進行血漿游離腫瘤DNA的監測后發現:在其中6個病人的血漿中都能檢測到耐藥的T790M突變及其隨治療周期延長而導致的濃度增加;此外發現T790M突變在時間上比通過X光拍片確認發生腫瘤惡化最早可以提前16周。

可見微滴式數字PCR對于血漿游離腫瘤DNA的檢測對于一線治療療效評估、耐藥突變的檢測以及個性化治療在臨床上的應用意義重大。

Simultaneous Quantification of Alternatively Spliced Transcripts in a Single droplet digital PCR Reaction

Simultaneous Quantification of Alternatively Spliced Transcripts in a Single droplet digital PCR Reaction

入選理由:首次將ddPCR應用于基因表達過程中不同選擇性剪切產物的研究,并與腫瘤發病的機理研究相結合。

發表期刊:BioTechniques 56:319-325 No.6 2014
作者:Bing Sun, Lian Tao, and Yun-Ling Zheng

章摘要:
選擇性剪接(alternative splicing)越來越成為基因表達調控的研究熱點,據估計人類70%編碼蛋白的功能基因都存在選擇性剪接的調控方式,并且也是導致腫瘤發生的原因之一。二代測序(NGS)技術能很好的用來研究、分析特定基因不同的選擇性剪接產物,但所需實驗成本較高,且需要較大量的RNA樣品。

目前為止,總共約有20種不同的人端粒酶逆轉錄酶(human telomere reverse transcriptase ,hTERT)的選擇性剪接產物被報導,其中主要的4種產物在多種腫瘤組織中都存在(α deletion: α-/β+; β deletion: α+/β-; α + β double deletion: α-/β-; no-deletion: α+/β+)。僅全長的轉錄產物才具有相關的端粒酶活性,超過90%的腫瘤組織的端粒酶活性相比于癌旁組織有顯著的升高,因此這些不同的選擇性剪接產物可以被用來進行癌癥機理的研究以及早期檢測等的分子標記物。

長期以來研究人員缺乏足夠靈敏和準確的技術來同時定量多種選擇性剪接的RNA轉錄子,本文采用了微滴式數字PCR對hTERT 4種不同的剪接產物進行絕對定量的研究,也是進行選擇性剪接此類研究的第一篇正式文獻。只需要一對引物,兩條TaqMan探針,無需標準品,就能在一個反應孔內,同時定量檢測四種hTERT選擇性剪接RNA轉錄子。

Structural haplotypes and recent evolution of the human 17q21.31 Region

Structural haplotypes and recent evolution of the human 17q21.31 Region

入選理由:第一篇采用ddPCR技術對大樣品條件下NGS數據進行驗證的文章。截止目前為止, ddPCR與NGS、Array聯用來進行CNV位點發現及確認越來越成為一種“標準化的流程”。

發表期刊:Nat Genet. 2012; 44(8), pp 881-885
作者:Boettger LM, Handsaker RE, Zody MC, McCarroll SA.;

文章摘要:
哈佛醫學院由Steven A McCarroll領導的實驗室對人17號染色體的17q21.31區域進行了深入研究,因為該區域復雜的基因組結構變異與神經性疾病以及婦女的不孕不育有關。

首先他們采用NGS進行了全基因組測序,在上述區域內發現了很多包括CNV在內的基因組結構變異,他們將該區域分成了3個大的片段。這時他們需要一種成本可控,高通量且快速的實驗方法來對NGS發現的CNV位點在大樣本的情況下進行驗證。

在文獻中,他們采用了ddPCR的方法來完成對大樣本的測試,結果顯示ddPCR的結果與NGS的數據高度吻合,相關性大于99%。

High Sensitivity Detection and Quantitation of DNA Copy Number and Single Nucleotide Variants with Single Color Droplet Digital PCR

High Sensitivity Detection and Quantitation of DNA Copy Number and Single Nucleotide Variants with Single Color Droplet Digital PCR

入選理由:首次在ddPCR上采用EvaGreen染料法實現了單孔、單通道情況下CNV和SNP的同時分析。

表期刊:Anal. Chem. 2014, 86, 2618?2624

作者:Laura Miotke, Billy T. Lau, Rowza T. Rumma, and Hanlee P. Ji;

文章摘要:
文獻是第一篇在伯樂公司升級后的QX200上采用EvaGreen方法由斯坦福大學的科學家完成的文獻。文章采用EvaGreen的方法僅利用單孔、單熒光信號通道就實現了對腫瘤細胞系和腸癌病人的臨床樣品進行了CNV和SNP的檢測,前者以FLT3基因為靶點,后者以BRAF V600E的靶點。

在實驗設計時,對不同擴增產物的長度進行控制,就能利用PCR反應結束后終點熒光信號強度的不同在一個反應孔內區分2種不同的產物。在FLT3 CNV的檢測中,可以區分FLT3目標基因與UC1內參基因;在BRAF V600E的突變檢測中,可以有效區分野生型與突變型對應的擴增產物。其檢測結果與采用TaqMan探針法的結果完全一致。與傳統的TaqMan探針相比,EvaGreen染料法在實驗的設計、優化以及成本的控制方面更具有推廣性。

Absolute Quantification by droplet digital PCR versus Analog real-time PCR

Absolute Quantification by droplet digital PCR versus Analog real-time PCR

入選理由:首次將ddPCR和qPCR在miRNA表達含量分析時結果的重復性進行了系統的統計學比較,證實了ddPCR方法的優勢。具有較高的引用率。

發表期刊:Nature Methods | ADVANCE ONLINE PUBLICATION doi:10.1038/nmeth.2633
作者:Christopher M Hindson, John R Chevillet, Hilary A Briggs, Emily N Gallichotte, Ingrid K Ruf, Benjamin J Hindson, Robert L Vessella & Muneesh Tewari;

文章摘要:
來自Fred Hutchinson癌癥研究中心等處的研究人員在《Nature Methods》發表文章證明了微滴式數字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR)技術能用于不同情況下,準確,可重復性的血漿和血清microRNA(miRNA)量化檢測,這將為miRNA及其它核酸用于循環生物標志物的檢測鋪墊了道路。

文章的第一作者,Fred Hutchinson癌癥研究中心人類生物學部Muneesh Tewari博士表示,“在循環系統miRNA診斷領域,微滴式數字PCR(ddPCR)能幫助我們進行生物標記物研究,直接比較同一實驗室跨天多次試驗,甚至不同實驗室之間的檢測結果?!?/span>

實時定量PCR(qPCR)已被廣泛用于血液樣品miRNA的分析測試中。但是研究人員發現,血清或血漿中的miRNA qPCR測量出現了極高的差異性,無法用作穩定的血液生物標志物的檢測標準,因此這一領域的研究人員一直在尋求一種能獲得更可靠結果的新方法。

數字PCR具有許多優于定量PCR的優點,比如無需標準曲線,以及不受不同樣品和試驗過程中PCR擴增效率變化的影響,就能獲得絕對定量。

為了評估每個工作流程的步驟,包括連續稀釋準備,反轉錄(RT)和PCR擴增,Tewari博士和他的團隊分別在三個獨立的工作日中,通過ddPCR嵌套分析對比定量PCR,對水和血漿中6種不同的合成miRNA各稀釋系列的cDNA進行分析,結果發現比較于qPCR,ddPCR在PCR特異性變化方面,具有更高的精確度(48-72%的更少變異系數)。

接下來,研究小組進行血清miRNA的qPCR和ddPCR并列比較檢測。他們收集了20例晚期前列腺癌患者,和20例年齡相匹配的男性對照血清樣品,分析其中的miR-141豐度,miR-141是一種已被證明的晚期前列腺癌的生物標志物。 研究人員分別在不同的三天里準備了qPCR和ddPCR分析的不同稀釋濃度,并進行了檢測,結果發現ddPCR相比于qPCR,能提高7倍不同一天里實驗室的重復率,這在對照研究中也得到了證實:ddPCR的結果更為可信(p=0.0036 vs. p=0.1199)。

Tewari博士說,“微滴式數字PCR將能幫助我們更加精確的追蹤病人治療期間不同時間段中的血清microRNA生物標志物濃度變化情況,這對于實時PCR來說,有時是不可能實現的?!?/span>

science med

Digital Genomic Quantification of Tumor-Infiltrating Lymphocytes

首次將多對TaqMan探針的assay和ddPCR結合使用,實現了對腫瘤浸潤性T淋巴細胞的分類。方法學上也證實了ddPCR與多重PCR結合使用的可行性。

表期刊:Sci Transl Med 5, 214ra169 (2013) 作者:Harlan S. Robins, Nolan G. Ericson, Jamie Guenthoer, Kathy C. O’Briant, Muneesh Tewari, Charles W. Drescher, Jason H. Bielas;

文章摘要:

來自Fred Hutchinson癌癥研究中心的研究人員利用ddPCR技術,首次對一種特殊的腫瘤攻擊性免疫細胞進行了定量。

腫瘤浸潤性T淋巴細胞(Infiltrating T lymphocyte),常常發現于惡性腫瘤中,并參與了宿主的免疫應答。多個獨立的研究已經證明了腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)的存在及其數量與生存率密切相關。但是由于方法學的限制,當前對TILs的檢測最多只能進行半定量。因此,不能利用TILs來進行臨床決策。

鑒于TILs的重要性,特別是考慮到其對癌癥預測的潛在效用以及它們在免疫應答中的作用,Fred Hutchinson癌癥研究中心的研究人員利用QX100系統開發了一種基于微滴式數字PCR的“QuanTILfy”檢測。由于適應性免疫細胞具有分子標簽,而且T細胞在其T細胞受體(T cell receptor, TCR)基因位點進行基因重排,這使得對TILs的定量成為可能?!癚uanTILfy”檢測可對組織中(包括腫瘤)的TILs進行定量,并對T細胞的克隆性進行評估。而且,研究人員還開發了一種分型系統來對“克隆性”進行分級,“克隆性”或許是藥物靶點的一個標記物。

在本研究中,Fred Hutchinson研究人員對30名卵巢癌患者的原發性腫瘤進行了QuanTILfy測定,這些患者已知生存預后在1-122個月之間。相比于生存期不到2年的患者,生存期超過5年的患者TILs出現率大約高3倍。這些結果表明,高水平TILs與患者生存呈正相關,支持了這一假說:TILs發揮了抑制腫瘤形成的作用。

QuanTILfy檢測被證實精確性和靈敏度極佳。在血液和正常人肺成纖維細胞純化出的人類T細胞的混合物中,這一檢測能夠在10,000個腫瘤細胞中檢測到一次TCR重排。重要的是,它也證實了ddPCR技術能夠通過多重檢測在一次反應中同時定量大量的標記物。

在對該項目的領導Jason Bielas(Fred Hutchinson癌癥研究中心公共健康科學部準會員)進行采訪時,Bielas表示“現在我們具備了在腫瘤細胞中實現重現性計數TILs的能力,我們或許能夠基于腫瘤TILs計數將患者進行分級,尤其是采用免疫療法給予更有效的治療?!?/span>

Tolerance of Droplet-Digital PCR vs Real-Time Quantitative PCR to Inhibitory Substances

Tolerance of Droplet-Digital PCR vs Real-Time Quantitative PCR to Inhibitory Substances

入選理由:首次通過實驗證實了微滴式數字PCR系統對PCR抑制物不敏感,尤其適合對復雜來源的樣品進行核酸分子的檢測與分析,具有較高的引用率。

發表期刊:Clinical Chemistry 59:11 (2013)

作者:Tanis C. Dingle, Ruth Hall Sedlak, Linda Cook, Keith R. Jerome;

文章摘要:

華盛頓大學醫學檢驗系和福瑞德?哈金森癌癥研究中心系統比較了微滴式數字PCR和傳統定量PCR對SDS、EDTA、Heparin(肝素,血液抗凝劑)等常見PCR抑制物的耐受程度。

通過計算和比較兩種平臺的抑制曲線和最大抑制濃度中值(IC50)表明,微滴式數字PCR對SDS、肝素的耐受度高于定量PCR方法。